酵母双杂交（Y2H）实验操作指南

酵母双杂交系统（Yeast two hybrid，Y2H）是一种常用的方法，用于研究两种蛋白质之间的相互作用。通过将两种蛋白质分别克隆到酵母表达质粒中的转录激活因子的DNA结合结构域（DNA-BD）和转录激活域（AD）上，构建成融合表达载体，可以实现对这两种蛋白质相互作用的分析。

pGBKT7是一种酵母双杂交bait表达载体，旨在表达GAL4 DNA结合结构域（DNA-BD,1-147 aa）与bait蛋白质的融合蛋白。而pGADT7则是另一种酵母双杂交表达载体，用于表达GAL4激活结构域（AD, 768-881 aa）与目的蛋白的融合蛋白。这种系统提供了一种有效的工具，可以帮助研究人员深入了解蛋白质间的相互作用机制。

一、酵母感受态细胞制备

(1) 将-80℃保存的酵母菌株在YPDA固体培养基平板上划线，30℃培养条件下倒置培养4-7d。

(2) 挑取单菌落至含3mLYPDA液体培养液中。

(3) 30℃培养，200rpm 震荡培养8h。

(4) 当菌液OD值约为0.3时，转移10uL菌液到含50mIYPDA培养液中。

(5) 30℃培养，200rpm震荡培养16-20h至OD值为015-0.3。

(6) 700g转速5min室温离心收集细胞。

(7) 将底部沉淀使用已预热至30℃的100mLYPDA中重悬酵母细胞。

(8) 30℃，200rpm，摇3-5h至OD值=0.6时。

(9) 5min室温离心收集细胞。

(10) 将底部沉淀在30mL无菌超纯水中重悬酵母细胞.

(11) 700g转速5min室温离心收集细胞。

(12) 将底部沉淀加入3mL的1.1XTE/LiAc重悬细胞。

(13) 将悬重悬细胞分成2管，6000g转速室温离心30s。

(15) 将底部沉淀加入500uL的1XTE/LiAc重悬酵母细胞，分装为100uL每管。

二、转化

（1）在干净的1.5 mL的离心管中并振荡混匀。

（2）每个离心管中加入100 ?L的酵母感受态细胞，500 ?L的PEG/LiAc溶液，加入两种质粒，并且将管中的混合物进行旋涡振荡，将其混匀。

（3）在30℃，220 rpm/min的摇床振荡培养30 min。

（4）往每个离心管中加70 ?L的DMSO，并温和的上下颠倒混匀。将离心管在42℃水浴中热激40 min（每隔10 min摇匀1次）。

（5）取出离心管，在冰上静置2 min。

（6）吸取100 ?L并涂布在相应的二缺固体培养基上，培养3-4天，待菌长好后，挑单菌落于10ulYPDA液体培养基中，30℃培养过夜。

互作验证：

取过夜培养的菌液涂布于四缺平板上，将培养皿置于30℃恒温培养箱中培养，观察是否生长与颜色变化。

注意事项：

（1）检测感受态细胞效率，标准操作规范。

（2）注意质粒使用量，检查仪器状态。

（3）配制新鲜培养基，并做对照转化，添加抑制剂，同时增设严格的对照组防止自激活。

（4）应挑选大的、新鲜的菌株克隆进行培养。